El equipo de investigación dirigido por el profesor Yao Honghong de la Universidad del Sudeste ha revelado el mecanismo molecular por el cual CircHECW2 regula la expresión de WTAP y GNG4, controlando así la disfunción de los astrocitos.

Los ARN circulares (circARN), un tipo de ARN no codificante, se generan mediante eventos de retrosplicing no canónicos y presentan una alta expresión en el sistema nervioso central (SNC). Numerosos estudios han demostrado su implicación en numerosos procesos patológicos y fisiológicos.

En abril de 2024, el equipo de investigación dirigido por el profesor Yao Honghong, de la Universidad del Sudeste, publicó un artículo titulado "Engagement of N6-methyladenisine methylation of Gng4 mRNA in astrocyte dysfunction regulatory by CircHECW2" en la revista Acta Pharmaceutica Sinica B (IF = 14,5). En este artículo, los autores descubrieron que el nivel de ARN circular HECW2 (circHECW2) aumentó significativamente en el plasma de pacientes con trastorno depresivo mayor (TDM) y en el modelo murino de estrés crónico impredecible (ESC). Cabe destacar que la regulación negativa de circHECW2 podría aliviar la disfunción astrocítica y los comportamientos similares a la depresión inducidos por el ESC. Además, se demostró que la regulación negativa de circHECW2 aumentó la expresión de la metiltransferasa WTAP, lo que provocó un aumento en la expresión de Gng4 a través de m⁶Una modificación que proporcionó información funcional sobre la correlación entre circHECW2 y m⁶Metilación. Esto indica que circHECW2 podría ser un objetivo potencial para el tratamiento del TDM.

circHECW2 está sobreexpresado en ratones CUS y pacientes con TDM

Cabe destacar que la actividad inducida por LPS y CUS Los modelos de depresión están bien documentados en estudios relevantes para depresión. El autor Un estudio anterior demostró por primera vez que los niveles de circHECW2 aumentaron en el hipocampo de LPS tratado ratones. Por lo tanto, para investigar la posible participación de circHECW2 en la depresión (Figura 1C y D), el autor aislaron el hipocampo y plasma recolectado de ratones CUS. A continuación, el autor examinó los niveles de circHECW2 en el plasma de pacientes con TDM y de individuos de control sanos (HC) y descubrió que los niveles de circHECW2 aumentaron notablemente en los pacientes con TDM (Fig. 1E). En particular, nuestro análisis reveló una correlación positiva entre los niveles de circHECW2 y las puntuaciones de la Escala de calificación de Hamilton para la depresión de 24 ítems (HAMD-24) (Fig. 1F), las puntuaciones de la Escala de calificación de depresión de Montgomery-Asberg (MADRS) (Fig. 1G) y las puntuaciones de la Escala de ansiedad de Hamilton (HAMA) (Fig. 1H). Además, a través del análisis de regresión lineal, el autor descubrió que los pacientes con TDM con niveles elevados de expresión de circHECW2 y puntuaciones altas en el cuestionario de trauma infantil (CTQ) mostraban síntomas de depresión más graves (Fig. 1J). Para evaluar la capacidad predictiva de los niveles de circHECW2 para los resultados del TDM, el autor examinó los cambios en el nivel de circHECW2 dos semanas después del tratamiento en el plasma de pacientes con TDM y encontró que el nivel de circHECW2 disminuyó 2 semanas después del tratamiento en el plasma de pacientes con TDM (Fig. 1K).

La regulación negativa de circHECW2 mejora los comportamientos inducidos por CUS

Después de la microinyección durante 2 semanas, el autor examinó la eficacia de la transducción lentiviral y descubrió que la expresión de circHECW2 disminuyó en los ratones inyectados con shRNA-circHECW2 (Fig. 2C). Se emplearon pruebas de comportamiento, incluyendo la prueba de preferencia por la sacarosa (SPT), la prueba de nado forzado (FST) y la prueba de suspensión de la cola (TST), para evaluar el efecto de circHECW2. La preferencia por la sacarosa en los ratones tratados con CUS disminuyó, lo cual indica anhedonia. Afortunadamente, este déficit se alivió significativamente mediante la regulación negativa de la expresión de circHECW2 (Fig. 2D). Tanto en el FST como en el TST, el tiempo de inmovilidad se prolongó notablemente en los ratones CUS, y estos efectos mejoraron notablemente en los ratones inyectados con shRNA-circHECW2 (Fig. 2E y F).

Papel de circHECW2 en la disfunción de los astrocitos en el hipocampo de ratones CUS

Posteriormente, el autor investigó el mecanismo celular a través del cual circHECW2 afecta la recuperación funcional después de CUS. Para evaluar más a fondo los tipos de células en los que la expresión de circHECW2 está regulada positivamente, el autor detectó la expresión de circHECW2 en astrocitos, microglia, neuronas y células endoteliales del cerebro de ratones CUS (Fig. 3A). Los resultados revelaron una sobreexpresión significativa de circHECW2 derivado de astrocitos en CUS, en comparación con circHECW2 derivado de microglía, neuronas o células endoteliales (Fig. 3B). Además, la tinción de hibridación in situ fluorescente indicó que circHECW2 era abundante en astrocitos (Fig. 3C). Además, el tratamiento con shRNA-circHECW2 mitigó significativamente la disminución de la expresión de GFAP observada en ratones CUS (Fig. 3D y E). Posteriormente, el autor detectó la función de shRNA-circHECW2 en los astrocitos.’Morfología mediante GFAP y reconstrucción 3D (Fig. 3F). El análisis de Sholl indicó que la disfunción de los astrocitos fue inducida por CUS, como lo demuestra una reducción en el número de ramas, la longitud y el volumen de los astrocitos. Cabe destacar que estos déficits mejoraron notablemente con el tratamiento con shRNA-circHECW2 (Fig. 3GeI). En conjunto, estos resultados sugieren que la sobreexpresión anormal de circHECW2 en los astrocitos podría representar un evento molecular crítico en la progresión de la depresión.

circHECW2 inhibe m⁶Una metilación mediante la regulación negativa de WTAP

Dado el papel potencial de m⁶Una metilación en MDD y la regulación mutua entre circRNAs y m⁶Una metilación, nos embarcamos en una investigación para determinar si el circRNA’El papel regulador de la m6A en los procesos patológicos de la depresión, particularmente en los mecanismos mediados por astrocitos, implica modificaciones de la m6A. La CUS provocó una disminución de los niveles de m6A en el hipocampo, un efecto que fue mitigado significativamente por shRNAcircHECW2, lo que indica una regulación de circHECW2 en m⁶Una metilación (Fig. 4A). A continuación, medimos la expresión de las enzimas modificadoras de m6A mencionadas anteriormente en modelos de ratones CUS tanto en los niveles de ARNm como de proteína, y encontramos que solo el nivel de proteína de WTAP se redujo en el hipocampo de los ratones CUS (Fig. 4B). Posteriormente, utilizamos astrocitos primarios de ratón transducidos con lentivirus shRNA-circHECW2 o plásmido sobreexpresado con circHECW2 para investigaciones adicionales (Fig. 4C y D). La expresión de WTAP aumentó significativamente en las células tratadas con shRNA-circHECW2 (Fig. 4E), mientras que el análisis Western blot indicó que circHECW2 no alteró los niveles de METTL3, METTL14, FTO y ALKBH5, lo que sugiere una asociación específica entre circHECW2 y WTAP. Para confirmar estos hallazgos, los astrocitos primarios se transdujeron con el plásmido sobreexpresado circHECW2 y WTAP disminuyó significativamente en los astrocitos (Fig. 4F). A continuación, se utilizó el ensayo pulldown para explorar la interacción entre circHECW2 y WTAP, y circHECW2 mostró una mayor afinidad por WTAP (Fig. 4G). Además, los experimentos in vivo demostraron que shRNA-circHECW2 mejoró significativamente la disminución de Expresión de WTAP inducida por el modelo CUS (Fig. 4H). Para explorar la causa de la disminución de WTAP tras el CUS, se empleó inmunoprecipitación para detectar la ubiquitinación. El nivel de ubiquitinación ligada a la lisina 48 (Ub-K48) de WTAP disminuyó significativamente tras la inhibición de circHECW2 en el modelo CUS (Fig. 4I).

A continuación, investigamos el efecto de circHECW2 y WTAP en la supervivencia de los astrocitos. Se utilizó corticosterona para simular la depresión in vitro. Los astrocitos transducidos con shRNAcircHECW2 mostraron una mejora de la disminución de la viabilidad inducida por la corticosterona (Fig. 4J). Por el contrario, la inhibición de la expresión de WTAP agravó significativamente la disminución de la viabilidad de los astrocitos tratados con corticosterona (Fig. 4K). Además, la disminución de la viabilidad de los astrocitos causada por el ARNip de WTAP fue mitigada por el ARNhc-circHECW2, lo que indica una estrecha relación entre circHECW2 y WTAP (Fig. 4L). Además, construimos un virus de inhibición (KD) AAVGFAP-WATP específico para astrocitos cerebrales. Tres semanas después de la microinyección de KD AAV-GFAP-WATP y lentivirus shRNAcircHECW2 en el hipocampo, los ratones fueron sometidos a CUS o a un control. Se examinaron experimentos de comportamiento, incluyendo SPT, FST y TST, tras cuatro semanas de exposición a CUS.

WTAP regula m⁶Una modificación del ARNm de Gng4 en la depresión

Para buscar la posible molécula descendente que participó en el ratón CUS, el autor publicó una detección de m en todo el transcriptoma⁶Una modificación en el hipocampo del ratón CUS en un estudio previo. El análisis de procesos biológicos de ontología génica (GO-BP) mostró que los genes regulados negativamente se enriquecieron en términos génicos asociados con el proceso celular. La región del ARNm con m alterada⁶Una modificación (genes regulados negativamente) (Fig. 5B). A continuación, se realizó un análisis de secuenciación de ARN en el hipocampo del modelo murino CUS. Se identificaron 288 genes con expresión diferencial en el análisis de secuenciación de ARN (valor de p ajustado por Cuffdiff).<0,05) (Fig. 5C). De particular interés, hubo 19 transcripciones superpuestas entre las dos comparaciones (Fig. 5D), lo que sugiere que estos genes pueden ser los genes objetivo involucrados en la disfunción de los astrocitos después de la CUS. Cabe destacar que estas 19 transcripciones superpuestas se verificaron a nivel de ARNm. En las 4 transcripciones sobreexpresadas, no se validó ningún gen. Además, la concentración plasmática de GNG4 disminuyó significativamente en pacientes con TDM. Asimismo, se observó una correlación negativa entre GNG4 y las puntuaciones de la escala HAMD-Deterioro Cognitivo. Con base en estos hallazgos, GNG4 emergió como un foco central en nuestro estudio del TDM. Además, analizamos la vía que involucra a GNG4 y su asociación con la disminución de m⁶Una modificación de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) (Fig. 5E). Luego, otros resultados indicaron que la modificación de m6A disminuyó en la región pico (chr13: 13825437e13825707) en el 30-UTR del ARNm de Gng4 (Fig. 5F y G). El autor empleó ensayos de luciferasa para comparar el tipo salvaje (WT) y el mutante m⁶Sitios con y sin tratamiento con ARNi WTAP. Estos ensayos demostraron que la mutación previno la metilación y aumentó la estabilidad del ARNm de Gng4 (Fig. 5H). Como era de esperar, la sobreexpresión de Gng4 mejoró notablemente la disminución de la viabilidad de los astrocitos tratados con corticosterona (Fig. 5I).

CircHECW2 regula la metilación m6A del ARNm de Gng4 a través de WTAP

Además, el autor examinó la expresión y función de GNG4 en el modelo de ratón CUS. Los niveles de ARNm y proteína de Gng4 disminuyeron significativamente en el hipocampo de ratones CUS, lo que fue consistente con la disminución de la modificación m6A de Gng4 (Fig. 6A y B). Además, para comprender la relación entre los niveles de Gng4 y el WTAP, se transfectó ARNi de WTAP en astrocitos primarios de ratón. La expresión de GNG4 y del ARNm de Gng4 está disminuida (Fig. 6C). Además, la sobreexpresión de circHECW2 condujo a una reducción de los niveles de ARNm y proteína de Gng4 (Fig. 6D). Por el contrario, la desregulación de circHECW2 en los astrocitos incrementó los niveles de ARNm y proteína de Gng4 (Fig. 6E). La cotransfección de ARNi WTAP y shRNAcircHECW2 indicó que el ARNi WTAP disminuyó el nivel de GNG4, que fue mejorado notablemente por shRNA-circHECW2 (Fig. 6F). Para validar estos hallazgos in vitro, se realizó un análisis de transferencia Western para evaluar los niveles de GNG4 en ratones CUS tratados con shRNA-circHECW2. Los resultados mostraron que El tratamiento con shRNA-circHECW2 mitigó significativamente la disminución en la expresión de GNG4 observada en ratones CUS (Fig. 6G y H). También construimos un virus AAV-GFAP-Gng4 KD específico para astrocitos cerebrales. Tres semanas después de la microinyección de lentivirus AAV-GFAP-Gng4 KD y shRNA-circHECW2 en el hipocampo, los ratones fueron expuestos a CUS o mantenidos en un estado control. Los resultados de SPT, FSF y TST revelaron que Gng4 astrocítico participa en la regulación de circHECW2 en la depresión (Fig. 6IeK).

La conectividad funcional del hipocampo con la corteza prefrontal se correlacionó positivamente con GNG4 en pacientes con TDM

Finalmente, se realizó un análisis de semilla a vóxel (conectividad funcional hipocampal), el cual mostró la conectividad funcional hipocampal (CF) con la corteza prefrontal (CPF) en pacientes con TDM. Como se muestra en las figuras 7A-C, la CF entre el hipocampo y la corteza prefrontal se redujo significativamente en pacientes con TDM en comparación con los pacientes con CC. A continuación, identificamos una disminución notable en la conectividad funcional en estado de reposo (rsFC) entre el hipocampo y la corteza prefrontal dorsolateral (Fig. 7D), mientras que otras regiones del cerebro, como la corteza visual y el lóbulo temporal inferior, no mostraron diferencias significativas. Además, encontramos una correlación positiva entre los niveles de GNG4 y rsFC, lo que sugiere que GNG4 puede desempeñar un papel en la función cerebral cognitiva de las personas con TDM (Fig. 7E).

Resumen

Nuestro estudio demostró que la regulación positiva de circHECW2 condujo a la disminución del ARNm de Gng4 a través de la modulación mediada por WTAP.⁶Una modificación provocó la disfunción posterior de los astrocitos. Específicamente, circHECW2 promovió la degradación de WTAP mediada por ubiquitina en el modelo murino CUS, y el efecto de GNG4 en el mantenimiento de las funciones normales de los astrocitos se elimina cuando se disminuye la expresión de WTAP en los astrocitos. Por lo tanto, el eje circHECW2/WTAP/GNG4 regula la disfunción de los astrocitos al disminuir la estabilidad de GNG4 a través de la modificación de m6A mediada por WTAP. En conclusión, nuestros hallazgos indican que circHECW2 es prometedor como diana terapéutica para el tratamiento de la depresión. Además, nuestro estudio arroja luz sobre el vínculo funcional entre circHECW2 y m⁶Una metilación que ofrece nuevos conocimientos para el desarrollo de estrategias preventivas y tratamientos efectivos para el TDM.